Den hellige Pafnutios ble født som Parthenius (ru: Parfenij; Парфений) i 1394 i landsbyen Kudinovo ikke langt fra Borovsk i Kaluga Oblast i Russland, atten mil sørvest for Moskva. Han var sønn av adelsmannen Johannes og hans hustru Fotinia. Hans farfar Martin var tatar og baskak (skatteinnkrever) for en tatarsk khan, men han var blitt døpt som kristen. Parthenius ble som tyveåring i 1414 munk i klosteret «Guds Mors forbønn» (Pokrovskij) «på høyden» (Vysotskij) nær byen Borovsk, også kalt Borovsk Vysotskij. Det lå på en høyde ved elven Protva. Av hegumen (abbed) Marcellus (Markell) mottok han tonsuren og klosternavnet Pafnutios. Det greske navnet Pafnutios (Παφνούτιος) har sin opprinnelse i det egyptiske pa-ph-nuti («Guds mann ») eller («det som tilhører Gud»). Navnet gikk inn i russisk som Pafnutij (Пафнутий).
Abbed Marcellus satte Pafnutios under veiledning av den hellige starets (eldste) Niketas av Vysotsk (Nikita) (ca 1360-ca 1450). Han hadde vært disippel av den hellige Sergius av Radonezj (ca 1314-92), deretter abbed for klosteret Vysotsk ved Serpukhov (1395-1414) før han ble skriftefar i klosteret ved Borovsk. I syv år sto Pafnutios under Niketas' veiledning og lærte alle dyder av ham. Av ham lærte han fattigdom, en fast kjærlighet til og dyp tro på Gud, samt et håp til Jomfru Maria, som han alltid hadde som støtte og åndelig trøst. Resultatet av denne opplæringen var at Pafnutios ble kysk og asketisk og fikk evnen til å se fremtiden og lese brødrenes tanker, å helbrede sykdommer og oppnå alt som ble bedt av Herren og den salige Jomfru. Han var sjenerøs og imøtekommende når det var nødvendig og streng når det var ønsket.
Rundt 1421 dro Niketas nordover, og i 1426 grunnla han Epifani-klosteret i Kostroma, som ligger der hvor elven Kostroma flyter ut i Volga og er det administrative senteret i Kostroma Oblast i det sentrale Russland. Niketas ba sin elskede disippel Pafnutios om å flytte til hans nye kloster i Kostroma, men abbed Marcellus lot ham ikke dra, for mens Niketas hadde vært borte, hadde Pafnutios blitt uunnværlig i klosteret som en som fortatte den åndelige forbindelsen med Sergius av Radonezj.
Pafnutios' flittighet i sitt liv som munk var så stor at abbed Marcellus døde i 1426, ble den 32-årige Pafnutios valgt av sine medbrødre til ny hegumen, og han ble presteviet av den hellige metropolitt Fotios av Kiev (i dag Kyjiv i Ukraina) (senere av Moskva). Pafnutios ble for sine munker et mønster på et arbeidsomt liv, men spesielt en krevende og klar åndelig far.
I de neste atten årene levde han i klosteret Pokrovskij ved Borovsk og tjente både som hegumen og eldste skriftefar. Han hadde gaver som hyrde og lærer og satte et enestående eksempel på kjærlighet og omsorg for sine brødre som var betrodd ham av Gud. I en av hans drømmer avslørte Gud for ham at to munker planla å rømme og at demoner i form av etiopiere kastet rødglødende svijern inn i deres celler. Pafnutios var dermed klar over at det var et spørsmål om deres evige liv, så han fikk dem bort fra deres fatale planer.
I en annen drøm så Pafnutios et tre fullt av vakker frukt dø i sin klosterhage. Han ga opp sitt andre arbeid og konsentrerte seg om treet og pleide det inntil det kom tilbake til livet. Det var åpenbart en av munkene som var borte fra klosteret, som hadde syndet, men angret og dermed unnvek dødssynden. Oppsummeringen av Pafnutios' drøm og hans liv var at han var en gartner i den hagen som er plantet av Gud.
I sin tid som abbed avslørte Pafnutios en rekke talenter. Han hadde en evne til å omvende mennesker og bringe dem til Gud, en altomfattende barmhjertighet og medlidenhet, en kompromissløs fasthet overfor enhver synd og en forbløffende innsikt og skarpsindighet.
Etter tretti år i klosteret, da Pafnutios var femti år gammel, ble han alvorlig syk og regnet ikke med å overleve, så han forberedte seg på døden. Da han likevel kom seg og fikk helsen tilbake, bestemte han seg for ikke å gjenoppta sine plikter som hegumen, men i stedet å trekke seg tilbake i ensomhet og vie resten av sitt liv til bønn og renselse av sin sjel.
Den 23. april 1444, på festen for den hellige martyren Georg, forlot Pafnutios klosteret Pokrovskij ved Borovsk sammen med én munk og slo seg ned ikke langt unna, på venstre bredd av elven Protva, der hvor elven Istrema renner ut i Protva. Flere og flere munker begynte å samle seg og slo seg ned rundt ham. Ifølge legenden viste Guds Mor seg for Pafnutios og ba ham om å grunnlegge et kloster og å bli dets hegumen. Han snakket om denne åpenbaringen først på sitt dødsleie.
Pafnutios grunnla i 1444 klosteret «Guds Mors fødsel» i Borovsk (nå klosteret Pafnutios av Borovsk eller Pafnutjev-Borovskij). Han tjente som et eksempel for sine brødre ved å føre et svært strengt liv. Hans celle var den fattigste, han sikret seg den verste maten, spiste ikke på mandager og fredager og spiste bare tørre måltider på onsdager. Han valgte det hardeste arbeidet: hogge og bære tømmerstokker, grave og vanne i kjøkkenhagen. Likevel var han alltid den første som kom til kirken til gudstjenestene.
En ny steinkatedral til ære for Jomfrufødselen ble bygd der hvor den første trekirken hadde stått, og veggene fikk fresker og ikoner malt av de beste ikonmalerne på den tiden, nemlig Dionysios (ru: Dionisij) (1440-1508) og hans assistenter med Metrofanes i spissen.
Pafnutios ble ikke bare elsket og aktet av munkene i sitt eget kloster, men også av andre. Det guddommelige forsyn brakte i 1459 den tyveårige Ivan Sanin til klosteret i Borovsk, hvor han fant hegumenen i ferd med å felle trær i skogen. Etter å ha testet den unge mannen gjorde Pafnutios ham til munk med navnet Josef, senere den hellige Josef av Volotsk (Iosef Volotskij) (ca 1439-1515), og han formet sin disippel i det åndelige liv. Josef skrev senere om sin lærer at han kunne være snill og overbærende, men også streng og rasende mot uangrende syndere. Hans åndelige barn hadde både stor aktelse for ham og fryktet ham. Når de gikk til skriftemål, var de overveldet av frykt.
Pafnutios' skarpsindighet ga ikke djevelen noen sjanse. En gang hadde ikonmaleren Dionisij brutt hegumenens forbud mot kjøtt, men han oppdaget at det lammet han i hemmelighet hadde brakt til klosteret, var infisert med mark og han var dekket av sår. Dionisij ble helbredet gjennom den helliges barmhjertighet. En munk som rakket ned på hegumenens ordrer, ble skremt av demoner i en drøm, og neste morgen kom han for å be hegumenen om tilgivelse. Selv etter sin død ba Pafnutios for sine disipler og tilhengere.
Pafnutios tilbrakte 63 år som munk. Kort før sin død, da han nektet å spise og lå til sengs, hadde gitt fra seg alle bekymringer og var dypt inne i sine botsøvelser, ble han spurt et spørsmål om den monastiske kommuniteten eller storfyrsten skulle bestemme over klosteret, svarte abbeden: «Den uplettede Theotókos (Guds Mor)». Deretter formante Pafnutios munkene til å arbeide i frykt og renhet for sin frelse slik at han kunne hvile i fred etter sin død. Han avsluttet: «Ha det travelt med å være gode». Da han var døende, kunne man høre englene synge i hans celle. Pafnutios døde den 1. mai 1477 som han hadde forutsagt, 83 år gammel.
Etter Pafnutios' død overtok hans disippel Josef som hegumen. Kort etter innførte han et strengt monastisk regime som ble avvist av munkene, så han måtte forlate klosteret. Han dro til fyrstedømmet Volokolamsk, hvor han grunnla et nytt kloster, senere kalt klosteret St. Josef Volotsk.
Pafnutios' minnedag er dødsdagen 1. mai. Klosteret i Borovsk fikk senere navnet St. Pafnutios av Borovsk (Pafnutjev-Borovskij) etter ham. Det er bevart to biografier skrevet av hans disipler: «Hagiografien om St. Pafnutios av Borovsk» av Vassian Sanin, biskop av Rostov og bror av Josef av Volotsk, og «Fortellingen om St. Pafnutios av Borovsks død» av den eldste Innokentij. Hans minnedag ble innført av konsilet i Moskva i 1547. Hans relikvier hviler fortsatt i klosteret St. Pafnutios.